微生物肥料生物安全通用技术准则（NY 1109-2006）

1　范围
本标准规定了微生物肥料使用菌种安全性分级目录、不同菌种及产品选择毒理学试验的原则、程序、试验方法和结果评价方法。
本标准适用于中华人民共和国境内生产、销售的微生物肥料。
2　规范性引用文件
下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。
GB 15193.3-2003   急性毒性试验
GB/T 4789.28-2003  食品卫生微生物学检验染色法、培养基和试剂
3　术语和定义
下列术语和定义适用于本标准。
3.1　
半数致死量  median lethal dose,LD50
是经口给予受试物后，预期能够引起动物死亡率为50%的单一受试物剂量，该剂量为经过统计得出的估计值。其单位是每千克体重所摄入受试物质的毫克数、克数或毫升数，即mg/kg体重、g/kg体重或mL/kg体重。
4　选择毒理学试验的原则
4.1　生产用菌种
微生物肥料生产用菌种分为四级管理，其安全分级目录见附录A。未列入附录A中的菌种，除根瘤菌和乳杆菌(Lactobacillus）外，其余均需做毒理学试验。
4.1.1  第一级（A.1）为免作毒理学试验的菌种。
4.1.2  第二级（A.2）为需做急性毒性试验的菌种。
4.1.3  第三级（A.3）为需做致病性试验的菌种。
4.1.4  第四级（A.4）为禁用菌种。
4.2  产品
4.2.1  除有机物料腐熟剂以外的固体微生物接种剂类产品均免做毒理学试验。
4.2.2  复合微生物肥料、生物有机肥和液体剂型微生物接种剂等需做急性毒性试验。
5　毒理学试验程序
5.1  菌种毒理学试验程序
5.1.1  应提供微生物肥料生产用菌种的鉴定资料，包括属及种的拉丁文学名和中文译名、形态、生理生化特性及鉴定依据、功能评价等资料。
5.1.2  根据产品所含菌种的鉴定资料，依据附录A之规定，确定菌种安全级别、是否做毒理学试验及毒理学检测项目。
5.1.3  对于需要做毒理学试验的菌种，生产者需提供试验用纯菌种斜面，经复核确认与该菌种鉴定资料相符且无杂菌污染后，进行毒理学试验。
5.2  产品毒理学程序
需对送检产品进行菌种和载体物料的真实性确认后，进行毒理学试验。
6　试验方法
6.1 受试物的准备
6.1.1  菌种受试物
将试验菌种接种于适宜的培养基中，在适宜的条件下培养一定时间，用生理盐水调整菌液浓度至2.0×108～2.0×109cfu/mL，该溶液为菌种受试物。
6.1.2  产品受试物
固体产品根据试验要求，配制所需浓度，溶剂首选去离子水，也可选用羧甲基纤维素、明胶、淀粉等。液体产品不可稀释，直接使用。
6.2  急性毒性试验
按GB 15193.3-2003执行。
6.3  致病性试验
致病性试验包括以下项目。
6.3.1  急性毒性试验
方法同5.2。
6.3.2  一次破损皮肤刺激试验
6.3.2.1  目的
检测受试物对实验动物皮肤的刺激/腐蚀作用和强度。
6.3.2.2  实验动物
每次实验至少需要3只皮肤完好的白色健康家兔或豚鼠。
6.3.2.3  操作程序
a)涂受试物前，将家兔或豚鼠背部脊柱两侧的毛去掉，去毛范围约2.5cm×2.5cm，用75%酒精清洁、消毒暴露皮肤，待酒精挥发后，用灭菌刀片或注射针头分别在两块皮区内划一个“＃”形的破损伤口。注意皮肤破损仅达表皮，不要伤及真皮。
b)将受试物0.5mL直接滴于破损皮肤上，或滴于同样大小的2层～4层纱布上并敷贴于破损皮肤表面，然后用一层无刺激塑料膜或油纸覆盖，再用无刺激胶布固定。另一侧去毛破损皮肤作为空白对照（或溶剂对照），敷贴时间为4h。试验结束后，用温水或无刺激性溶剂除去残留受试物。
c)分别于去除受试物后1h、24h和48h观察皮肤局部反应，并按表1进行刺激反应评分。注意鉴别感染和原发性刺激反应的区别，若有感染可疑，应进行重复测试。
6.3.2.4  评价规定
在各个观察时间点，按照表1对动物的皮肤红斑与水肿形成情况进行评分，并按时间点将3只动物的评分相加，除以动物数，获得不同时间点的皮肤刺激反应积分均值（刺激指数）。取其中最高皮肤刺激指数，按表2评定该受试物对动物皮肤刺激强度的级别。

　
表1  皮肤刺激反应的评分标准

表2  皮肤刺激强度分级

6.3.3  溶血试验
6.3.3.1  目的
检测受试物是否具有溶血特性。
6.3.3.2  操作程序
用无菌棉拭子蘸取菌种受试物, 以蛇形线接种于血琼脂平板(按GB/T4789.28-2003中4.6规定),置36℃±1℃培养箱中培养, 24h后观察有无溶血环产生。同时用已知阳性菌株金黄色葡萄球菌等作为对照。
6.3.3.3  试验结果
    菌落周围有溶血环的，则溶血试验阳性；否则为阴性。
6.3.4  抗菌药物敏感试验
质控菌株可选用大肠杆菌ATCC25922等标准菌株。
6.3.4.1  目的
检测受试物对抗生素的敏感性强度。
6.3.4.2  试验用抗生素
可选用头孢哌酮（CFP）、四环素（TE）、头孢唑啉（CZ）、链霉素（S）、俐特灵（FR）、环丙沙星（CIP）、复方新诺明（SXT）、氯霉素（C）、氨苄青霉素（AM）、庆大霉素（GM）、强力霉素（DO）、丁胺卡那霉素（AN）、甲氟哌酸（PEF）、氟啶酸（ENO）、多西环素(DO)、依诺沙星(ENO)、阿米卡星(AN)等中的几种。
6.3.4.3  操作程序
a) 用无菌棉拭子将受试物均匀涂抹于营养琼脂平板表面，共涂抹3次。每涂抹1次，平板应转动
60º，最后将棉拭子绕平板边缘涂抹一周。盖好平皿,置室温干燥5min。
b）用无菌棉拭子蘸取浓度为2.0×108～2.0×109cfu/mL质控菌株菌悬液，均匀涂抹于营养琼脂平板表面，具体方法同上，作为对照试验。
c)以无菌操作取出抗生素纸片分别贴在涂有受试物和质控菌株菌悬液的平板培养基表面，每个平板放4个纸片。然后将平板置于36℃±1℃恒温培养箱中培养18h后观察抗生素纸片周围有无抑菌环，量取并记录其直径（包括纸片直径）大小，单位mm。试验应做3个平行，取其均值。
d)质控菌抑菌环应均在质控范围内，说明试验方法准确可靠，否则试验无效。
6.3.5  急性腹腔注射致病性试验
6.3.5.1  目的
检测受试物的急性致病性。
6.3.5.2  试验动物
清洁级健康成年小鼠，体重18～20g。
6.3.5.3  操作程序
a）选健康成年小鼠40只,体重18～20g，雌、雄各半，剂量为500mg/kgBW，按0.1mL/10gBW经腹腔注射受试物。
b）于腹腔注射后第3d、7d分别取存活的实验动物雌、雄各5只解剖，并做大体病理学观察。
c)腹腔注射后第14d将剩余实验动物处死、解剖并做大体病理学观察。
6.3.5.4  结果观察、评价
根据试验周期内动物有无死亡及出现的中毒体症、大体病理学观察及病理组织学检查发现病变的程度进行分级判定（见表3）。
表3 急性致病性判定标准

6.3.6   急性眼刺激试验
6.3.6 .1  目的
检测受试物对实验动物眼睛的急性刺激和腐蚀作用。
6.3.6.2  实验动物
3只家兔，试验前检查家兔双眼，有异常者不能用于试验。
6.3.6.3  操作程序
a）吸取受试物0.1mL,滴入家兔一侧眼结膜囊内，另一侧眼以生理盐水作为正常对照。
b）滴受试物后，将眼被动闭合4s,30s后用生理盐水冲洗。于滴眼后1h、24h、48h、72h、7d、14d和21d，肉眼观察家兔眼结膜、虹膜和角膜的损伤与恢复情况。如果72h内未出现刺激反应，或第7d或第14d，眼睛刺激反应完全恢复，即可提前终止试验。必要时，用2%荧光素钠溶液或裂隙灯、放大镜检查角膜及虹膜变化。
6.3.6.4  评价规定
按表4对家兔眼角膜、虹膜和结膜的急性刺激反应进行评分，并分别计算每只动物在三个不同观察时间（24h、48h和72h）角膜损害、虹膜损害、结膜充血和结膜水肿四方面的“平均评分”（即每只动物的24h、48h和72h评分之和除以观察数3）。分别以动物眼角膜、虹膜和结膜充血、水肿的平均评分和恢复时间进行评分，按表5或表6眼刺激反应分级标准判定受试物对眼睛的刺激强度。
表4  急性眼刺激反应的评分标准

表5  眼刺激反应分级标准

表6   眼刺激性反应分级标准

7　结果评价
凡毒理学试验结果评价为有毒的产品，不得生产和销售；有毒或致病性试验结果不符合的菌种,均不得作为微生物肥料生产用菌种。
7.1  急性毒性试验
根据半数致死量（LD50）数值,判定受试物的毒性分级, 半数致死量(LD50)剂量分级按GB 15193.3-2003附录D执行，凡LD50>5000mg/kgBW的，可通过，即该菌种可作为生产用菌种或该产品可进行生产、销售。
7.2  致病性试验
7.2.1 急性毒性试验
结果判定同6.1。
7.2.2 一次破损皮肤刺激试验
如结果为无刺激或仅具轻度刺激作用，可通过；否则，应放弃使用。
7.2.3 溶血试验
溶血试验结果为阴性的，可通过；否则，应放弃使用。
7.2.4 抗菌药物敏感试验
受试菌株必须对两种以上的抗生素敏感；否则，应放弃使用。
7.2.5 急性腹腔注射致病性试验
结果为无急性致病性可通过；否则，应放弃使用。
7.2.6 急性眼刺激试验
结果对眼无刺激性或具有轻刺激性的，可通过；否则，应放弃使用。
　
附录A
（规范性附录）
菌种安全分级目录
A.1  第一级：免作毒理学试验的菌种
A.1.1  根瘤菌类                       
Azorhizobium caulinodans                           茎瘤固氮根瘤菌（田菁（茎瘤）根瘤菌）
Bradyrhizobium elkanii                               埃氏慢生根瘤菌（慢生大豆根瘤菌）
Bradyrhizobium japonicum                          日本慢生根瘤菌（慢生大豆根瘤菌）
Bradyrhizobium liaoningense                       辽宁慢生根瘤菌（慢生大豆根瘤菌）
Mesorhizobium huakuii                                  华癸中生根瘤菌（紫云英）
Mesorhizobium loti                                        百脉根中生根瘤菌
Rhizobium etli                                              埃特里根瘤菌（菜豆）
Rhizobium leguminosarum biovar phaseoli       豌豆根瘤菌（菜豆生物型）
Rhizobium leguminosarum biovar trifolii         豌豆根瘤菌（三叶草生物型）
Rhizobium leguminosarum biovar viceae          豌豆根瘤菌（蚕豆生物型）
Sinorhizobium fredii                                   费氏中华根瘤菌（快生大豆根瘤菌）
Sinorhizobium meliloti                                苜蓿中华根瘤菌
还包括尚未确定种名的，从一些豆科植物根瘤内分离、纯化、鉴定、回接、筛选后在原宿主植物结瘤、固氮良好的根瘤菌，如花生、绿豆、沙打旺根瘤菌等。
A.1.2  自生及联合固氮微生物类         
Azospirillum lipoferum                                  生脂固氮螺菌
Azospirillum brasilense                                  巴西固氮螺菌
Azotobacter beijgerinckii                                拜氏固氮菌
Azotobacter chroococcum                               褐球（圆褐）固氮菌
Azotobacter vinelandii                                   棕色固氮菌
Azotobacter paspali                                       雀稗固氮菌
Beijerinckia indica                                        印度贝氏固氮菌
A.1.3  光合细菌类                     
Rhodobacter capsulatus                                  荚膜红细菌
Rhodobacter sphaeroides                                类球红细菌(球形红杆菌)
Rhodopseudomonas acidophila                        嗜酸红假单胞菌
Rhodopseudomonas gelatinosa                        胶质红假单胞菌
Rhodopseudomonas globiformis                      球形红假单胞菌
Rhodopseudomonas palustris                           沼泽红假单胞菌
Rhodopseudomonas rutila                              血色红假单胞菌
Rhodopseudomonas sulfidophila                     嗜硫红假单胞菌
Rhodopseudomonas viridis                             绿色红假单胞菌
Rhodospirillum fulvum                                  黄褐红螺菌
Rhodospirillum rubrum                                  深红红螺菌
Rhodospirillum salinarium                             盐场红螺菌
Rubrivivax gelatinosus                                  胶状红环菌（胶状红长命菌）
A.1.4  分解磷钾化合物细菌类           
Bacillus amyloliquefaciens                              液化淀粉芽孢杆菌
Bacillus laterosporus                                      侧孢芽孢杆菌
Bacillus licheniformis                                    地衣芽孢杆菌
Bacillus megaterium                                      巨大芽孢杆菌
Bacillus mucilaginosus                                  胶胨样芽孢杆菌
Bacillus subtilis                                            枯草芽孢杆菌
Bacillus thuringiensis                                     苏云金芽孢杆菌
Thiobacillus thiooxidans                                氧化硫硫杆菌
A.1.5  促生细菌类                     
Paenibacillus azotofixans                               固氮类芽孢杆菌
Paenibacillus polymyxa                                 多粘类芽孢杆菌
A.1.6  酵母菌类                       
Candida guillermondii                                    季也蒙假丝酵母
Candida membranaefaciens                            膜醭假丝酵母
Candida tropicalis                                         热带假丝酵母
Candida utilis                                               产朊假丝酵母
Endomycopsis fibuliger                                  扣囊拟内孢霉
Pichia farinosa                                     粉状毕赤酵母
Pichia membranaefaciens                               膜醭毕赤酵母
Saccharomyces cerevisiae                               酿酒酵母
Rhodotorula rubra                                        深红酵母
A.1.7  放线菌类                       
Frankia sp.                                                  弗兰氏克菌（固氮放线菌）
Streptomyces chingyangensis                          泾阳链霉菌
Streptomyces microflavus                                细黄链霉菌
A.1.8  AM真菌类                      
Glomus mosseae                                            摩西球囊霉
A.1.9  其它                           
Lactobacillus parabuchner                              类布氏乳杆菌
Lactobacillus acidophilus                               嗜酸乳杆菌
Lactobacillus bulgaricus                                 保加利亚乳杆菌
Lactobacillus casei                                         干酪乳杆菌
Lactobacillus delbruecki                                 德氏乳杆菌
Lactobacillus lactis                                        乳酸乳杆菌
Lactobacillus plantarum                                 植物乳杆菌
Pediococcus pentosaceus                                戊糖片球菌
Streptococcus lactis                                    乳酸链球菌
Streptococcus thermophilus                       嗜热链球菌
A.2  第二级：需做急性毒性（LD50）试验的菌种
Arthrobacter aurescens                                   金黄节杆菌
Aspergillus candidus Link                               亮白曲霉
Aspergillus niger                                            黑曲霉
Aspergillus oryzae                                          米曲霉
Aspergillus penicillioides Speg                        帚状曲霉
Aspergillus wentii Wehmer                             温特曲霉
Eurotium chevalieri Mangin                            谢瓦散囊菌
Bacillus brevis(Brevibacillus brevis)                短芽孢杆菌
Bacillus circulans                                          环状芽孢杆菌
Bacillus coagulans                                        凝结芽孢杆菌
Bacillus pumilu                                             短小芽孢杆菌
Bacillus sphaericus                                        球形芽孢杆菌
Brevibacterium sp.                                         短杆菌
Burkholderia fungorum                                  真菌伯克霍尔德氏菌
Chaetomium  cochliodes                                 螺卷毛壳
Chaetomium trilaterale                             三侧毛壳
Clostridium pasteurianum                          巴斯德梭菌
Geobacillus stearothermophilus                        嗜热脂肪地芽孢杆菌
(Bacillus stearothermophilus)                         
Geotrichum candidum                                    白地霉
Nocardia sp.                                                 诺卡氏菌
Nocardiopsis sp.                                            拟诺卡氏菌
Paenibacillus macerans                                  浸麻类芽孢杆菌  
Penicillium citreonigrum                                黄暗青霉
Penicillium citrinum                                       桔青霉
Penicillium frenguentans                                常现青霉
Penicillium glabcum                                      光孢青霉
Pseudomonas fluorescens                                荧光假单胞菌
Promicromonospora citrea                              柠檬原小单胞菌
Pseudomonas putida                                      恶臭假单胞菌
Pseudomonas stutzeri                                     施氏假单胞菌
Pseudomonas vesicularis                                泡囊假单胞菌
Rhizopus oryzae                                             米根霉
Sphingobacterium multivorum                         多食鞘氨醇杆菌
Sporotrichum thermophile                               嗜热侧孢霉
Streptomyces albidoflavus                               微白黄链霉菌
Streptomyces fradiae                                      弗氏链霉菌
streptomyces griseospiralis                              灰旋链霉菌
Trichoderma harzianum                           哈茨木霉
Trichoderma koningii                                     康宁木霉
Trichoderma viride                                        绿色木霉
A.3  第三级：需做致病性试验的菌种
Acinetobacter calcoaceticus                            乙酸钙不动杆菌
Acinetobacter baumannii                                鲍氏不动杆菌
Alcaligenes denitrificans                                反硝化产碱菌
Alcaligenes faecalis                                       粪产碱菌
Alcaligenes xylosoxidans                                木糖氧化产碱菌
Bacillus cereus                                              蜡样芽孢杆菌
Enterobacter agglomerans                              成团肠杆菌
Enterobacter cloacae                                     阴沟肠杆菌
Enterobacter gergoviae                                  日勾维肠杆菌
Pseudomonas alcaligenes                                产碱假单胞菌
Pseudomonas diminuta                                   缺陷假单胞菌
Proteus sp.                                                    变形菌
A.4  第四级：禁用菌种
Erwinia sp.                                                  欧文氏菌
Klebsiella pneumoniae                                   肺炎克雷伯氏菌
Klebsiella oxytoca                                         产酸克雷伯氏菌
Pseudomonas aeruginosa                               铜绿假单胞菌