随着微生物在酵母饲料、酵素蛋白饲料、复合酶制剂、复合饲用微生态制剂(益生素)等的固态发酵饲料制品中的应用和发展，一些不利和有害微生物在生产中的污染问题也显得愈来愈突出，它们严重影响生产的正常运行和产品品质。无疑，这也是各个生产单位的重要研究课题之一，尤其是对于较粗放和敞开式固态发酵方式来讲，防治杂菌污染实际上是关系到整个发酵饲料行业走向正常生产管理轨道，获得较为纯净的生物制品的非常重要的一个方面。
    　　笔者认为，治菌不如防菌，对于不利和有害微生物的污染必须采取综合的防治措施。例如注意清洁卫生，选择性地控制有害微生物生长繁殖的物理化学环境，采用必要的防腐(细菌)和防霉(霉菌)剂，以及严格制定杀菌消毒制度等，这些都是相辅相成的。本文就笔者多年来在国内数家固态发酵单位从事技术指导工作时在杂菌防治方面的一些浅陋经验作一简单介绍。
    1　微生物污染的来源及其危害
    1.1　空间环境
    　　发酵饲料生物制品的生产大多使用曲霉、酵母和一些细菌作为菌种，它们都是各厂家根据自己的生产目的而分离筛选出的“需要的”有用微生物菌种。广义而言自然界还包括不同属性各种性状的酵母、霉菌、细菌、放线菌；还有病毒、立克次氏体、原生动物和藻类等，它们有的对发酵有益，有的对发酵有害甚至是人类的致病菌。不论是有益还是有害，只要不是厂家需要的目的菌，它均属于“杂菌”范畴。
    　　我们的防治目的主要还是针对有害菌。微生物都很微小，容易附着在人体或物体上，以人为载体到处移动，并从人体或物体上分离到空气中，附着在灰尘上，到处漂浮。所以，空气中的杂菌源自于空中的灰尘，车间的灰尘颗粒洁净度，即象征着无菌程度。
    　　空气中的杂菌非常复杂，对于有严格防菌制度的菌种室而言，空气中微生物大都为生产中使用的酵母、曲霉孢子或细菌，杂菌较少。但在操作中稍有不慎，也会造成一、二、三级种子污染，进而在四级种子敞开培养时，表现为大量污染而无法使用。污染菌大多为高温杆菌、黑根霉等，严重时出现异味，造成停产待种。空气环境中杂菌对成品发酵的影响相对较小。
    1.2　原材料污染源
    　　在各类油料饼粕、麦麸、玉米粉、食品及酿造行业下脚料、鱼粉中，含有大量的霉菌孢子，多为黑根霉，在鱼粉中更是含有沙门氏菌和绿脓杆菌等致病性芽孢杆菌，在较潮湿的环境中及含水较高的培养料上生长极快，原料中又以麦麸的根霉孢子含量最多。当用鱼粉作原料之一时，一定要在121℃的温度下灭菌30min以上才能保证生产安全。
    　　生产中若灭菌不充分，或经常在菌种室区域搬运及使用麦麸等原料，极易造成制种阶段污染根霉，在使用100%麦麸作制种培养基时，严重的造成里外皆霉，防不胜防。在使用浅盘法生产菌种时，料厚若高于8cm，则易造成物料内层的厌氧和高温环境，滋生大量杆菌，并产生异味。当然，这也与上一级种子质量优劣有关。
    1.3　人体污染源
    　　在按严格无菌制度操作的菌种室和有无菌处理要求的场所，发生污染的最大可能原因是由人体上的微生物混入空气中而造成的，在1d内人体可以释放出几亿个菌，尤以头发中最多。
    　　人体主要微生物分布为：头发和头皮中有许多葡萄球菌，棒状杆菌及其它革兰氏阳性细菌；手掌上常有葡萄球菌和芽孢杆菌等；口中常检出有葡萄球菌、链球菌、棒状杆菌等；耳、鼻、眼中有葡萄球菌、芽孢杆菌、棒状杆菌及革兰氏阳性细菌等；人的皮肤表面的菌亦很多；衣服及物品上微生物的类型及数量则更多；另外还附着有大量霉菌孢子。由于每个人所保持的清洁度不同，其数量有很大差别。
    　　在种子制作阶段，这些微生物很容易进入种子中造成污染。葡萄球菌是一种极难控制的有害细菌，由于某些球细菌的生长繁殖条件与耐渗透压的生产用酵母相似，故而常常在发酵阶段大量繁殖，使产品出现极为不爽的气味，严重降低产品品质。实际上在PH为4.5～5.5的高蛋白基料及高渗水平上的固态发酵常出现的污染是球细菌，而极少污染霉菌和杆状细菌。人体则是造成球细菌污染的根本和主要原因。
    1.4　其它污染源
    　　许多污染源也是相互关联的，例如空气中的杂菌最难控制，它们来源于物料、物品及人的活动，并漂浮于空气中。所以最有效的防范措施在于严格的卫生制度和行为约束制度，然后才是严格的空间消毒杀菌和原料灭菌规程，并注意生产车间的周围环境。
    2　污染的检测
    2.1　用沉降法检测空气中微生物
    　　2.1.1操作过程　制备好固体培养基平板，当需要测定空间某处杂菌污染情况时，打开培养皿盖，暴露一定时间；盖上培养皿盖，于适宜温度下，倒置培养一定时间，观察比较菌落的多少，镜检菌落的类别。
    　　2.1.2注意事项　要分别制备细菌、霉菌等培养基平板，分开测定；暴露的时间根据具体情况而定，空气干净则暴露时间长一些，反之时间短一些；此法只能说明空气中杂菌污染的大致情况，不能计算空气杂菌密度；测定的高度、部位视具体情况而定，在同一房间中，最 好分开放置几个培养皿。
    2.2　接种法计算空气中杂菌密度
    　　准备好一定体积的无菌水，将一定体积的空气全部通过无菌水，微生物则被阻留在水中，用一定量的该水接种到培养皿中，进行培养，观察长菌情况，将数得的菌落数进行换算，即可得单位体积空气中的杂菌数。
    2.3　原料、人体、污染源中杂菌定性观察
    　　可采取简单的取样、定量定容、无菌地接种到平板上，培养并进行观察鉴别和计数。
    2.4　生产中杂菌检测观察结论(见表1)
    表1　杂菌污染情况及根本来源(或“宿主”)　%
    
    污染物 黑根霉 葡萄球菌 杆状细菌 其它 合计
    一级种子 5 80 14 1 100
    二级种子 10 80 8 2 100
    三级种子 80 15 4 1 100
    四级种子 90 5 4 1 100
    发酵生产 10 80 8 2 100
    “宿主” 原料 人体 人体、原料 人体、原料 　
    注：表中百分比指该杂菌可能造成污染的程度，并非绝对污染。其它指其它霉菌。“宿主”指某杂菌至少90%以上来源于该污染源。
    　　对于空气而言，一般只是一种将杂菌从人体和物料上污染到生产物料中的中间介质，不是根本的“宿主”，故表中并未列出。
    　　实践证明，对于最终发酵产品而言，好气性球细菌等比较难以控制，许多厂家由于管理不善及技术不过关，使产品细菌含量严重超标。
    3　杂菌预防措施
    　　本文仅就关键的制种阶段的杂菌防治作一简单的介绍，由表1可知，制种阶段易污染黑根霉，严重时使制种无法进行下去，严重影响菌种活力和质量。另外还必须注意葡萄球菌污染，尽管在制种时它不是主要污染菌，但进入发酵阶段则可发展为主要污染菌。球细菌与杆状细菌的防治与操作人员的无菌观念和责任心有很大关系。
    3.1　菌种生产工艺条件
    　　即培养基配方及培养环境条件，这是首先应考虑到的。微生物的污染是防不胜防的，尽管有最 先进的设备，也不能绝对防止它进入培养料中。所以制定一个具有高度选择性的生产工艺条件是上策，更何况我们都习惯于那些比较粗放简单的生产方式。
    　　3.1.1配方　生产中切忌采用营养过于丰富或碳氮比极高的培养基配方，在二、三、四级种子阶段采用具有驯导作用的配方是很有效的。例如在以菜粕为主原料的固态发酵生产中，在种子配方中可采用在二、三、四级种子培养基配方中逐步放大菜粕用量的方法，同时配合其它配方技术，既可有效地防止杂菌污染，又可得到较高的细胞含量。同时，种子也得到了三步驯导，有利于发酵生产。
    　　过于丰富的培养基的第一个弊端在于细胞生长过旺过快，加上空气扩散速度跟不上，使物料内部产生高温可达50℃和缺氧环境，使厌气性高温杆菌和球菌大量繁殖，产生不良气味。其次，在湿度较高的底部会生长成片的黑根霉菌块。笔者认为，以油料饼粕、淀粉质原料复配，使基料蛋白含量在25%～35%为宜，同时加入1.5%～5%的无机盐(根据本厂菌种渗透压耐性而定)，来调节渗透压，抑制杂菌生长，必要时加入盐酸溶液以调节PH值到5.0左右。
    　　3.1.2物料水分和环境湿度　水分对微生物来说有非常重要的意义，各种营养成分必须先溶解于水，才能被细胞利用。需水量的多少，随微生物种类而不同，一般来说水分的需要程度是细菌＞酵母＞霉菌。保持环境的相对湿度也是很重要的，基质中的水分，特别是表面部分的含水量，随空气中的湿度变化而呈正相关变化。与微生物的发育有密切关系的，不是绝对水分含量(%)，而是水份活性(简写为AW)，基质中含的水分不能全部为微生物所利用，其中一部分得溶解基质的成分，因此与可溶性物质少的基质相比，可溶性物质多的基质水分活性就低，微生物的繁殖就相对地不容易。可溶性物质一旦溶于水，水的一部分就捕获这种物质，水的蒸汽压就会降低，假如纯水的水蒸汽压为P0(25℃)，基质中水的蒸汽压为P(25℃)，则这种基质的水分活性AW＝P/P0。
    　　控制基质AW对于控制根霉的污染具有很重要的意义，主发酵酵母菌往往是耐高渗的，所以有意识地在基料中复配一定的无机盐类，适度地降低水分活性，提高水中渗透压，可有效地抑制根霉菌的生长，同时又可使基质保持较高的绝对含水量，并且不会在培养过程中较快的干涸。另一方面，在后序的生产发酵中，往往加水比仅1∶0.52～0.62，水活性AW更低，故而在三、四级种子培养料中加入适当盐类，更有驯导的作用，大大缩短发酵延滞期。
    　　从表2、表3可知，黑根霉较容易控制并有效地抑制其生长。但对好气条件下的葡萄球菌来说，其对AW的要求接近于曲霉菌，某些葡萄球菌甚至可耐0.82以下的水活性，它们会在种子扩大培养中累积生长并潜伏下来，在连续通风发酵生产中表现出较严重的污染。
    表2　某些盐类饱和溶液所显示的水分活性(25℃)普通微生物的发育最低水分活性(AW)
    
    盐类 AW 盐类 AW 微生物 发育的最低AW
    KCl 0.842 K2G2O7 0.980 普通细菌 0.90
    NaCl 0.752 KNO3 0.924 普通酵母 0.88
    KBr 0.807 BaCl2 0.901 普通霉菌 0.80
    MgCl2 0.330 SrCl 0.708 好盐细菌 ≤0.75
    NaNO3 0.737 Mg(NO3)2 0.528 耐干渗霉菌 0.65
    K2CO3 0.427 K(C2H3O2) 0.224 耐渗酵母 0.61
    表3　一些生产用菌及污染微生物的发育及AW的关系
    
    微生物 发育最低AW 微生物 发育最低AW
    肉毒杆菌 0.98 玫瑰式小球菌 0.90
    蜡样芽孢杆菌 0.97 嫌气金黄色葡萄球菌 0.90
    沙门氏菌 0.95 好气金黄色葡萄球菌 0.87
    绿脓极毛杆菌 0.94 黑曲霉 0.86
    黑根霉 0.93 灰绿曲霉 0.81
    大肠杆菌 0.92 扣囊拟内孢霉 0.769
    八叠球菌属 0.91 白地霉 0.842
    　
    　　空气中湿度以70%～80%为宜，过高易滋生霉菌、细菌，过低则基质水分散失过快，不利于种子生长。
    　　3.1.3温度与供气　料温不得高于40℃，否则杆状细菌会大量繁殖，持续高温，将使种子过早衰老死亡，得到的种子质量、活力不高，发酵延滞期较长。料温最 好控制在32℃左右，对于5cm厚的三级种子浅盘培养而言，宜在培养10h后，断掉培养室内热源。仅靠料温及种子本身生长产热维持培养，22h可成熟出料，该法是针对密封性较好的培养室而言的，夏天则应注意降温。对于培养量较大的四级种子生产，则空间应注意通风换气，并且易于控制温湿度为宜。
    　　3.1.4酸碱度　微生物的生长繁殖受环境酸碱度(PH值)的影响，与温度条件一样，各种微生物有自己最适的PH范围。一般来说，细菌尤其是有害细菌的最适PH范围是中性偏碱(PH＝7～8)，大多数酵母和霉菌的最适PH范围是弱酸性(即PH＝4～6)，与细菌相比，酵母和霉菌生长的PH范围较广些。微生物在超过PH的最适范围外的环境中，生长便受到抑制，甚至发育受阻，因此，控制基质的PH，就可控制微生物的繁殖和活动。例如调节基料PH在4.0～5.5之间，可控制且遏止有害细菌的生长，而不影响酵母、曲霉的生长。另外，有些发酵设施也可采用酸处理的方法来预防杂菌生长，如湖南有家私营企业，采用竹扁上竹架的大规模发酵生产酶制剂产品，日产0.5t，年创利润80多万元，但细菌产氨味问题一直没有得到解决。尽管采取了各种遏止方法都无济于事，成为数年来的一块心病。后来发现，是由于竹扁太多，劳动强度大，在清洗和消毒竹扁时，不能完全杀死竹扁上残留的细菌。既然无法全部杀死，则最 好的方法是抑制，于是在竹扁清洗后，用1%盐酸溶液配合消毒水对竹扁进行喷雾处理，晒干后再用于发酵，就从根本上解决了长时间发酵(72h)隐藏的产氨味问题。
    　　以上各种工艺条件对于制种来讲，应是相辅相成的，总之，各种微生物都有自己最适宜的生长条件。因此只要我们有目的地控制这些条件，人为地破坏杂菌的生长条件，就可以防止或减少杂菌的污染。
    3.2　加强原料管理，车间合理布置、严格灭菌操作
    　　黑根霉等来源于各类原料，必须加强原料管理。原料必须严格灭菌才能进行制种，原料配合和预处理车间必须远离或隔离于制种车间，杜绝一切使原料在车间内频繁搬动的操作，不使用发霉结块和变质的原料，使用的水要干净清洁。
    3.3　注意环境卫生及个人卫生
    　　充实必要的自动化设备，尽量做到不用手工操作；墙壁天花板的涂料中应配合高效低毒的防霉剂以防止发霉；建立工作服的清洁卫生和消毒灭菌制度。对于无菌室、菌种室及培养室建立定期的空间、地面等消毒灭菌制度。
    　　注意车间的通风、除尘、干燥和消毒，尽可能减少和杜绝微生物的污染源。
    　　注意个人卫生，在无菌室或其它要求无菌处理的场所，必须采取完全防止从人体释出微生物的措施。
    　　实验和操作后，要及时处理现场，尤其是残留培养基和残留菌种，要及时地进行清洗和灭菌处理。
    　　在抓好管理的同时，要对职工经常进行培训，培养无菌意识，建立无菌概念，有效的防止杂菌污染。